中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所近日在《Horticulture Research》發(fā)表了文獻為《Targeted creation of new mutants with compact plant architecture using CRISPR/Cas9 genome editing by an optimized genetic transformation procedure in cucurbit plants》。本文獻中采用了LUYOR-3415RG熒光蛋白激發(fā)光源來篩選GFP陽性的植株。
文獻摘要（譯文來自谷歌翻譯，并非原作者翻譯）
葫蘆科的水果和蔬菜，如黃瓜、甜瓜、西瓜和南瓜，對人類飲食有很大貢獻。基因組編輯技術(shù)的廣泛使用極大地加速了基因功能表征和作物改良。然而，大多數(shù)經(jīng)濟上重要的葫蘆科植物，包括甜瓜和南瓜，仍然對標準的根癌農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化具有抗拒性，從而限制了基因組編輯技術(shù)的有效使用。在本研究中，我們采用“佳滲透強度"策略建立了的甜瓜和南瓜遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。我們利用這種方法的力量來靶向ERECTA的同源物受體激酶基因家族，并創(chuàng)造了等位基因，導致甜瓜、南瓜和黃瓜中節(jié)間較短的緊湊植物結(jié)構(gòu)。此處介紹的優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的 CRISPR/Cas9 介導的誘變，并為葫蘆科作物的功能基因操作提供了堅實的基礎(chǔ)。
葫蘆科長期以來被認為是難轉(zhuǎn)化的作物之一，嚴重阻礙了基因組編輯工具的應用。在黃瓜和西瓜中已經(jīng)報道了成功的遺傳轉(zhuǎn)化和基因組編輯[ 13 , 14 ]。然而，黃瓜的轉(zhuǎn)化效率仍然很低，用于西瓜再生的間接器官發(fā)生目前與其他葫蘆科作物不兼容。因此，其他經(jīng)濟上重要的葫蘆科作物，如甜瓜和南瓜，仍然難以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，這極大地阻礙了功能基因組研究和快速產(chǎn)生賦予這些作物理想性狀的突變。
農(nóng)桿菌浸潤被認為是建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的關(guān)鍵。在器官發(fā)生過程中，不定芽從不同植物物種的原形成層或形成層細胞開始 [ 25 ]，這些組成了農(nóng)桿菌感染的靶組織。然而，盡管以前的研究認識到需要感染外植體的更深細胞層，但尚未開發(fā)出統(tǒng)一的標準協(xié)議來實現(xiàn)這一目標。在實踐中，必須在感受態(tài)細胞的充分感染和整個外植體的過度感染之間取得良好的平衡，這會導致嚴重的損傷并降低轉(zhuǎn)化效率。
為了克服這些問題，我們采用了佳強度的浸潤策略來確定特定的一組條件，以確保血管組織中的形成層細胞*感染，同時對外植體造成盡可能小的損傷。在這里，我們確定了真空滲透、超聲處理和微刷的佳強度，以獲得良好的甜瓜和南瓜轉(zhuǎn)化效率，我們還在培養(yǎng)基中添加了抗氧化劑 LA，以保護外植體免受損傷。在這些優(yōu)化的條件下，維管組織感染有效，外植體損傷小，導致甜瓜和南瓜的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，效率約為4%。使用相同的策略，我們提高了不同黃瓜種質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率，并部分克服了基因型依賴性。
這種在葫蘆科作物中且穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)使我們能夠在這些物種中進行 CRISPR/Cas9 介導的基因組編輯。擬南芥ER基因家族編碼富含亮氨酸的重復受體樣激酶，已被證明可調(diào)節(jié)莖伸長 [ 27 ]。編輯瓜類ER同源物在甜瓜、南瓜和黃瓜中產(chǎn)生了er突變體。所有突變體都具有較短的節(jié)間和矮化表型，這可能有利于改善植物結(jié)構(gòu)和育種。
總之，我們提出了一種穩(wěn)定的甜瓜和南瓜遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并證明 CRISPR/Cas9 介導的基因組編輯在這些葫蘆科作物中是有效的。這里描述的方法將大大加快對葫蘆科作物的研究，包括基礎(chǔ)植物生物學和優(yōu)良品系的創(chuàng)造。
植物材料和生長條件
本研究分析了十個甜瓜品種：P147（栽培甜瓜）、ivf105（栽培甜瓜） 、m1（栽培甜瓜）、m2（栽培甜瓜）、m3（栽培甜瓜）、m4（栽培甜瓜）、m5（野生甜瓜） , m6 (栽培甜瓜), m7 (栽培葡萄) 和景玉（商業(yè)雜交種），其中 ivf105 和 m1 到 m7 由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所（IVF）王懷松提供。本研究使用黃瓜自交系Cu2（華南型）、新太米刺（華北型）、404（華北型）和Eu1（歐洲型）的種子。兩種商業(yè)moschata材料，金心針4號和金心針11號，用于南瓜改造。在分化和生根階段將所有組織培養(yǎng)物保持在培養(yǎng)室中。生根后，將再生植物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中約一周，然后在溫室中種植，光照條件為 16 小時光照/8 小時黑暗，溫度范圍為 18°C 至 24°C。
需要使種子發(fā)芽以獲得外植體，種子發(fā)芽的條件如下。將種子在 50°C 的溫蒸餾水中浸泡 30 分鐘，然后用鑷子去除種皮。種子用 75% 乙醇 15 秒和 1% 次氯酸鈉溶液 15 分鐘進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水沖洗 6 次。瓜子、南瓜和黃瓜的滅菌種子在 28°C 下在含有 7.5 mL 滅菌水的培養(yǎng)皿上涂抹 1-2 天。在 28°C 下，僅將 Cu2 種子散布在含有 GM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。
sgRNA設(shè)計和質(zhì)粒構(gòu)建
sgRNA 是使用 CRISPR-GE 網(wǎng)絡(luò)工具 設(shè)計的。如前所述 [ 49 ] 將 sgRNA 插入 pBSE402 載體。簡而言之，將含有 1.5 μL 100 μM 正向引物、1.5 μL 100 μM 反向引物、5 μL 10× NEB 緩沖液 3.1 和 42 μL 水的 50 μL 混合物在 95°C 下孵育 5 分鐘，然后升溫以 0.1°C/s 下降到 20°C，產(chǎn)生一個短的雙鏈 DNA 片段。使用限制酶Bsa I 和 T4 連接酶 (New England Biolabs)將短 DNA 片段插入 pBSE402 。將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105。引物顯示在表 S2。
檢測 GFP 熒光
為了篩選 GFP 陽性植物，在組織培養(yǎng)階段使用 Leica MZ10 F 立體顯微鏡（Leica Microsystems，Germany）檢查再生一個月的外植體。在溫室中用LUYOR-3415RG激發(fā)光源（Luyor Instrument，上海）激發(fā)后觀察植物的綠色熒光蛋白GFP熒光。將不同感染強度處理的外植體在冰上沿橫向和縱向手工切片，在立體顯微鏡下立即觀察到有血管組織部分的GFP熒光。
上圖為：（a，b和c）GFP強度，感染維管組織的外植體，以及五種不同處理下甜瓜m1的存活率，分別。 數(shù)據(jù)是三個重復的平均值，誤差線表示標準偏差。 不同的小寫字母表示差異顯著（p<0.05，Tukey 檢驗）。 (d) 將再生的轉(zhuǎn)基因 T0 甜瓜植物轉(zhuǎn)移到土壤中。 轉(zhuǎn)基因甜瓜 T0 植物的 GFP 熒光頂端分生組織 (e) 和種子 (f 和 g)。 LUYOR-3415RG 的 GFP 通道下甜瓜的轉(zhuǎn)基因 T1 植物 (h) 和 WT (i)。 組織因 GFP 表達而呈綠色，因葉綠素自發(fā)熒光。
注：文獻內(nèi)容由谷歌翻譯，并非原作者翻譯
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